1月27日，清華大學化工系生物育種技術與裝備團隊在《核酸研究》（Nucleic Acids Research）發表文章，采用高通量手段系統研究了sgRNA與靶標DNA錯配效應對dCas9結合活性的影響。

近年來，作為可編程的DNA靶向工具，CRISPR/(d)Cas系統在基因編輯、高通量遺傳篩選、染色體成像、合成基因路線構建、新型抗菌藥物和體外核酸檢測等領域得到了廣泛的應用。對于每個應用而言，向導RNA（sgRNA）與靶標DNA之間的序列同源性對CRISPR/(d)Cas系統活性的影響都是至關重要的。為加深對這個問題的理解，作者在大腸桿菌中構建了兩個覆蓋所有單核苷酸和雙核苷酸突變的sgRNA文庫，并利用高通量的方法在活細胞內解析了文庫中每個sgRNA介導dCas9與靶標DNA結合的親和力。

圖1 高通量解析不同錯配sgRNA對dCas9與靶標結合活性的影響

該研究基于高通量實驗手段發現種子區域（PAM近鄰7-12 bp）的錯配對結合活性的影響較大，而PAM遠端區域可以容忍多個錯配；種子區的錯配存在協同效應，即兩個錯配的組合對結合活性的影響大于兩個對應單獨錯配影響的加和。特別的，相對于其它錯配類型，dDrG（D = A, T, G）對dCas9結合的影響相對溫和，與核酸熱力學數據呈現出一致性，并得到了進一步的實驗驗證。

圖2 錯配sgRNA介導的CRISPR/dCas9結合活性的系統解析

CRISPR/(d)Cas9識別并結合靶標主要分為兩個步驟，首先是PAM （NGG）的識別及其近鄰堿基的熔化，接著是鏈侵入過程，即sgRNA與熔化的靶標DNA發生退火，并延伸至PAM遠端。基于CRISPR/(d)Cas9的結合機理和實驗觀測，論文將鏈侵入過程的狀態轉移視作馬爾可夫鏈，并使用文獻報道的核酸熱力學數據計算每個狀態的概率，最終發現dCas9的解離概率與結合親和力存在較強的負相關關系，并能很好的與文獻報道的體外實驗數據吻合。該模型也能外推至更多錯配的情形，一定程度上證明了其普適性，對于深入理解和應用CRISPR系統的脫靶結合效應具有重要意義。

圖3 CRISPR/dCas9的結合親和力受核酸熱力學控制

化工系張翀副教授和王天民博士（現為清華大學醫學院博士后）為本文通訊作者，生物育種技術與裝備團隊首席邢新會教授為本文共同作者。馮匯寶博士研究生、郭佳薈博士、王天民博士為本文的共同第一作者。該成果得到了國家自然科學基金委重點儀器研發項目、面上項目和博士后基金的資助。

論文鏈接：https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkaa1295/6121456