前言

      微生物個體微小、構(gòu)造簡單、進化地位低、分布區(qū)域廣，在不同的生存環(huán)境進化形成了各具特色的生態(tài)系統(tǒng)。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征的相關分析對從土壤微生態(tài)方面降低作物種植成本、提高品質(zhì)具有重要實踐意義。同時復雜的生存環(huán)境為土壤微生物帶來了豐富的生物多樣性和獨特的生化機制以及代謝途徑，使其在新型生物活性物質(zhì)的生產(chǎn)方面擁有著巨大的潛力。

      但從復雜的土壤微生物菌群中篩選出合適的菌株始終是一個工作量比較大的任務。傳統(tǒng)方法篩選菌種的一般步驟為：菌種采集→富集培養(yǎng)→純種分離→性能測定→菌種保藏，該方法步驟繁瑣、耗時較久，需要投入巨大的工作量和重復勞動。因此為了增加篩選效率，科研人員不斷的去構(gòu)建新型的篩選理論和自動化設備，諸多方法也已經(jīng)成功的被應用在了土壤微生物的篩選領域，如變性梯度凝膠電泳法、實時熒光定量 PCR和微陣列等。

      天木生物高通量微升級液滴培養(yǎng)組學系統(tǒng)（single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics）是基于液滴微流控技術開發(fā)的微型化高通量單細胞培養(yǎng)及分選裝備，可以實現(xiàn)對環(huán)境菌群在單細胞水平上進行分離培養(yǎng)，液滴生成后存儲于高透氣性管路中進行孵育，最后通過光學信號（OD、熒光、化學發(fā)光等）進行檢測分選，分選后的液滴進入多孔板中，用于后續(xù)實驗。

實驗過程

      本案例使用天木生物高通量微升級液滴培養(yǎng)組學系統(tǒng)作為基礎構(gòu)建了土壤微生物的高效篩選模型。

      本次實驗樣本為野外土壤，稱取2g樣品，加入5倍體積的生理鹽水和玻璃珠，4℃過夜震蕩。靜置沉降后取上清，用血球板計數(shù)，根據(jù)上清中菌含量稀釋成3個濃度梯度（樣品A，B，C），上機生成液滴，室溫培養(yǎng)。同時按照MISS cell上樣濃度的5倍分別制成樣品D、E、F，涂平板，室溫培養(yǎng)并統(tǒng)計菌落數(shù)。

      液滴盤培養(yǎng)15-45天，從60882個液滴分選出帶菌液滴5628個，同時涂布平板共88個，統(tǒng)計菌落數(shù)共761個。測序結(jié)果顯示：原始土壤中共檢測出1264種菌，液滴體系中共檢測出86種菌，平板體系共檢測出73種菌（圖2）。其中液滴中鑒定出50多種未能在平板中獲得的菌株，包括布魯氏菌、缺陷短波單胞菌等7大類的菌只在液滴中富集。同時由于液滴是單細胞包裹后培養(yǎng)，收集液滴中超過95%是可以進行鑒定后保藏。

結(jié)論

      本案例以OD閾值作為篩選依據(jù)，對土壤中的多種微生物進行了有效分離，并成功檢測出了86株不同的微生物，比傳統(tǒng)方法篩選種類高了17.8%，同時大大降低人工成本。該方法證明了微流控篩選系統(tǒng)在土壤微生物分離中的有效性。

圖1 土壤微生物篩選實驗流程

圖2 原始土樣、液滴和平板富集的細菌測序結(jié)果

圖3 原始土樣、液滴和平板富集的細菌種類差異